20 分钟检测新冠!诺奖得主开辟核酸检测新技术，基于 CRISPR 完成疾速诊断

起源：丁香学术 2021-08-17 12:38

以后，COVID-19 活着界范畴内年夜风行，已形成超过两亿人次的感化和四百多万人次的累计灭亡，基于 qRT-PCR（定量逆转录酶-聚合酶链反馈）的检测是以后诊断 COVID-19 的金尺度。虽然说这种办法具备很高的敏理性，但其操作仍旧过于简单，检测光阴长达数小时，无奈完成疾速的即时检测。是以，开辟比 qRT-PCR 更疾速、更容易施行的检测战略显得尤为紧张。

CRISPR/Cas 体系是用于基因编纂的分子生物学对象，有精确辨认和切割特定 DNA 和 RNA 序列的才能。2020 年的诺贝尔化学奖也颁给了 CRISPR 基因编纂技术。随后，多项 CRISPR-Cas9 基因编纂临床试验开启并得到突破性成果，并已胜利利用于人类疾病的医治。

与 Cas9 卵白分歧，Cas13 卵白特异靶向 RNA 序列，可能在切割靶 RNA 之后仍坚持活性，并且能够表示出不加区其余切割活性。这一个性使其不克不及被用于基因编纂，但对来说倒是个共同的劣势，例如通过切割降解已标志的核酸来发生荧光旌旗灯号，具备被利用于核酸检测的后劲。

加州年夜学伯克利分校 Jennifer Doudna（2020 年的诺贝尔化学奖得主之一）、David Savage 和 Patrick Hsu 三位迷信家引导的研讨团队在 Nature Chemical Biology 杂志上在线颁发了题为 Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases 的文章。

研讨职员联合了两种分歧的 CRISPR 酶，发明了一种能在一小时内检测到少量病毒 RNA 的办法，这种被称之为疾速串联集成核酸酶检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem， FIND-IT）的无扩增技术，可认为许多沾染病及以后风行的 COVID-19 提供疾速且便宜的战略。

次要研讨内容

LbuCas13a 联合嗜热栖热菌 Csm6（TtCsm6）可用于疾速 RNA 检测

Csm6 是一种 III 型 CRISPR-Cas 体系的 RNA 内切酶，可被激活以切割细胞中的各类 RNA 分子，基于其旌旗灯号缩小的内源性功效，有能够进步 RNA 检测的敏理性。

通过挑选，研讨职员发现寡核苷酸 A4-U6 可联合并刺激 TtCsm6 对申报卵白的切割，并开释出荧光分子。此外，分歧浓度的 A4-U6 激活 TtCsm6 后，在 20-30 分钟内呈现荧光增长，随后到达一个平台值，终极荧光程度与 Csm6 激活剂的数目成反比。

在荧光曾经趋于安稳的 LbuCas13a-TtCsm6 反馈中退出 A4-U6 激活剂可以迅速添加 TtCsm6 对靶序列的切割，而增加更多的靶 RNA 或 TtCsm6 则没有影响。这些数据标明 Csm6 的 A4 P 配领会跟着光阴的推移而耗尽，从而使其 RNA 切割活性失活，而这种失活则限定了其发生荧光旌旗灯号的数目。

Csm6 激活剂的化学修饰

为相识决 Csm6 激活剂失活的难题，他们想到了位点选择性化学修饰的办法，试验成果发现，这种战略不仅可以避免激活 Csm6 的寡核苷酸的降解，同时还能坚持 Csm6 的高程度激活状态，使其可以重复切割和开释与 RNA 相关的荧光分子。敏锐度比未修饰的 A4-U6 激活剂进步了 100 倍。

RNA 检测的可编程性

为了使 TtCsm6 及其修饰的激活剂可能用于进步 RNA 检测的敏锐度和检测速率，必需保留用于串联检测的 CRISPR 核酸酶的可编程个性。

为此，他们将 TtCsm6 及其激活剂增加到一个 LbuCas13a 卵白中，该卵白具备分歧的 crRNA 序列，可以靶向 COVID-19 病原体 SARS-CoV-2 的 RNA 序列。采取分歧的 crRNA 序列进行检测，发现其具备类似的敏锐度和能源学，这标明，这种「一步法」可以对分歧的 crRNA 序列进行编程，是以能够实用于简直任何 RNA 序列的检测。

为了确定增加 TtCsm6 是否能放慢检测光阴，他们在反馈 20 分钟后比拟了这两种检测战略的成果，发现同时含有 LbuCas13a 和 TtCsm6 的试剂盒在 20 分钟内即可实现对每微升 31 个拷贝的样品检测。

综上这些成果标明，通过优化 LbuCas13a 的 crRNA 和化学修饰的 TtCsm6 激活剂，串联 CRISPR 核酸酶检测可能完成对沾染性病原体 RNA 序列的无扩增检测，在减速检测病原体的同时兼具高敏锐度，他们称这种战略为疾速串联集成核酸酶检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem， FIND-IT）。

聚拢检测器完成 FIND-IT 即时检测病毒 RNA

末了，为了证实将上述 FIND-IT 归入即时测试流程的可行性，他们开辟了一种便捷检测器，该检测器由一个带有反馈室的微流控芯片、一个将反馈维持在 37℃ 的加热模块和一个荧光成像体系构成。