Chemical Science：smFRET检测GPCR调控上游卵白arrestin的构象散布研讨中获停顿

G卵白偶联受体（GPCR）是今朝已知的人类基因组中最年夜的膜卵白家族，约30%的临床处方药的间接靶点是GPCR，担任80%左右的跨膜旌旗灯号转导，参加调控人体中多半病理与心理进程。GPCR次要通过G卵白及arrestin将细胞外的刺激转变为细胞内旌旗灯号。近年来，构造生物学研讨办法的提高为研讨GPCR及其上游卵白arrestin和G卵白的功效奠基了优越的根底。今朝，研讨GPCR及上游卵白构造的罕用办法次要有晶体学、NMR、冷冻电镜。然而，通过晶体或电镜构造得到的信息，关于GPCR构造和功效的懂得往往只能从静态程度动身，较难捕捉GPCR构象动静转换的能源学进程以及与上游卵白互相作用时的瞬时调理进程。NMR 光谱可捕捉GPCR及其上游卵白的动静进程，却不克不及检测其构象状态散布。

后期任务中，山东年夜学传授孙金鹏与中国迷信院生物物理研讨所传授王江云研讨团队，针对受体与arrestin互相作用的磷酸化编码机制开展了研讨任务，发现了GPCR磷酸化编码机制，提出了受体磷酸化的“笛子模子”实际【Nature Communications 6， 8202 (2015)】。基于“笛子模子”的实际根底，该单干团队进一步提醒了GPCR磷酸化编码别构调控SH3 domain卵白的多聚脯氨酸船埠分选机制【Nature Chemical Biology 14， 876-886 (2018)】。近日，该单干团队联合晶体学、DeSiPher和BRET等妙技，检测了GPCR单个磷酸化位点缺点可惹起arrestin远端功效构造域发生分歧的构象变动，并发现了其与arrestin生物学功效的相关性【Nature Communications 12， 2396 (2021)】。

为捕捉GPCR调控上游卵白arrestin的构象状态散布，王江云团队、孙金鹏团队，以及清华年夜学传授陈春来团队单干，在Chemical Science上在线颁发了研讨论文Single-molecule FRET and conformational analysis of β-arrestin-1 through genetic code expansion and Se-Click reaction。科研团队应用基因暗码扩大技术选择特同性的将非人造氨基酸SeF拔出到arrestin的特定位点，然后将荧光染料Bodipy593特同性标志到SeF，从而完成将Bodipy593在arrestin上的定点标志作为受体，同时，研讨团队在arrestin的特异位点拔出了CCPGCC用以标志FlAsH-EDT2来作为供体，借助清华年夜学TRIF荧鲜明微镜平台，通过点击反馈进行单分子FRET检测磷酸化GPCR调控arrestin的分歧构象状态散布。

该办法立异性天时用基因暗码子扩大技术将非人造氨基酸SeF整合到arrestin的特定位点，通过代替反馈完成了高效率、特同性标志Bodipy593，标志后的SeF-Bodipy593相比拟Bodipy593呈现了47 nm的红移，更能下降旌旗灯号的配景乐音。相比传统的Cy3-Cy5标志办法，防止了arrestin卵白中的一切Cysteine渐变，SeF-Bodipy593和FlAsH以更短的linker完成了染料对卵白的特同性标志，更易精准的检测出arrestin在激活前后巨大的构象变动及其状态散布。(100yiyao.com）