起源：清华年夜学性命学院 2021-11-12 08:20

RNA具备多种紧张的心理功效，可在编码、基因表白、基因调控和酶催化等进程发扬作用。RNA功效的发扬与其可折叠造成简单的三维空间构造以及构象的动静变动亲密相关，在联合配体(例如卵白质、DNA/RNA、小分子等)或相应情况 (例如离子浓度、温度、pH或机器力)变动时，RNA往往产生构象状态的转变。研讨标明，RNA的三维空间构造通常是在二级构造的根底上，由共轴沉积、假结构造(pseudoknot)、A-小沟模体(A-minor motif)以及“吻式”发夹(kissing loop)等三级互相作用模体(tertiary interaction motifs)稳定的。以后，人们对相关三级互相作用若何调控RNA的构象动静以完成RNA的多种心理功效的机制相识甚少。

黄病毒包含登革病毒、寨卡病毒和西尼罗河病毒等可在人群中惹起感化，并招致一系列潜在的重大疾病。因为仍短少无效的药物和疫苗，黄病毒的传达仍继续在环球造成安康威逼。黄病毒抗核酸外切酶RNA(xrRNA)是一类位于黄病毒基因组3’非翻译区的RNA构造元件(图1a)，可以折叠成共同的环状构造(图1b)，并抵制宿主5’→3’核糖核酸外切酶Xrn1的降解，招致宿主细胞中亚基因组RNA(sfRNA)的造成与积聚，后者与病毒的致病性和免疫逃逸亲密相关。研讨标明，在黄病毒家族中，xrRNA的一级序列与高级构造都是高度激进的。在稳定其环状高级构造的三级互相作用模体中，存在两个假结构造PK1和PK2，此中PK1的长度为2 bp，而PK2的长度从2-7 bp不等(图1c)。黄病毒xrRNA的PK2长度变动的心理意义，包含对xrRNA的构造、构象动静以及抵制Xrn1的降解功效的影响尚不分明。

清华年夜学性命学院方显杨与陈春来课题组单干，在《自然通信》 (Nature Communications)在线颁发了题为“假结长度调控黄病毒xrRNA的折叠、构象动静与抗Xrn1酶切活性”(Pseudoknot length modulates the folding， conformational dynamics， and robustness of Xrn1 resistance of flaviviral xrRNAs)的研讨论文。在该项研讨中，方显杨与陈春来课题组单干倒退了基于非人造碱基体系的长链RNA位点特同性荧光探针标志办法，提醒了黄病毒xrRNA的PK2长度变动对其折叠、构象动静和抗酶切活性调控的分子机制，相关研讨结果为利用单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术展开长链RNA的构象动静与功效关系的研讨以及拓展黄病毒xrRNA在生物医学和生物资料中的潜在利用奠基了根底。

smFRET技术是研讨生物年夜分子构象动静的紧张伎俩，其利用条件是完成生物年夜分子位点特同性的荧光探针标志 (图2a)，而RNA特殊是长链RNA的位点特同性荧光探针标志非常具备挑战性。在该研讨中，基于非人造碱基体系(NaM-TPT3) (图2b)，研讨者起首倒退了长链RNA位点特同性荧光探针标志办法，通过堆叠延伸PCR及体外转录， 别离向DNA模板和RNA转录本的特定位点引入非人造碱基对和炔基修饰的TPT3，进一步通过点击化学反馈将叠氮修饰的荧光探针与炔基修饰的RNA耦联，从而完成对RNA的位点特同性荧光探针标志(图2c-d)。该标志技术突破了传统标志办法如化学合成等对RNA分子量的限定，可以高效、疾速的完成对长链RNA位点特同性的荧光探针标志，将极年夜的推进smFRET技术在长链RNA构象动静研讨中的利用。

接上去，研讨者整合小角X射线散射(SAXS)、smFRET以及抗Xrn1酶切能源学，研讨了来自黄病毒家族的11种PK2长度分歧(2-7 bp)的xrRNA在溶液中的折叠、构象动静及抗Xrn1酶切活性(图1d-f)。SAXS和酶实在验数据标明，xrRNA在溶液中的折叠(图1d)和抗酶切活性(图1e)均高度依赖于[Mg2+]，而且遭到PK2长度的调控，PK2长度较长的xrRNA在较低的Mg2+浓度即可折叠为环状高级构造并具有抵制酶切的才能。smFRET试验数据标明(图1f)，xrRNA在溶液中是高度动静的，存在未折叠态、中心态及折叠态三种状态，三种状态的比例散布遭到[Mg2+]及PK2长度的协同调控，其能源学遵循由未折叠态到中心态再到折叠态的折叠途径。xrRNA在折叠态的比例与酶切降解速度之间的负相关性标明，xrRNA只有进入折叠态时能力抵制酶切，而且遭到解折叠能源学进程(由折叠态到中心态或未折叠态)的节制，因而，xrRNA的构造、构象动静与其抗酶切功效亲密相关。进一步的研讨标明，在高[Mg2+]前提下，PK2较长的xrRNA可以缓解因三级互相作用模体如PK1或J2/3的渐变而对其构造、动静个性和抗酶切活性的影响。综合这些试验成果，研讨者们提出了黄病毒xrRNA在溶液中受Mg2+及PK2长度协同调控的折叠自在能面图(图1g)。这些研讨结果提醒了黄病毒xrRNA的构造、构象动静与功效之间的高度相关性和由三级互相作用模体调控RNA构象动静与功效的新机制。(100yiyao.com）