来源：BioArt 2025-12-08 16:10

该研究为理解微生物免疫的模块化进化提供了关键实验证据。

细菌与古菌长期面临噬菌体的持续感染压力，驱动了CRISPR-Cas、CBASS、Avs等多样化抗病毒系统的进化。这些系统常通过将新基因整合到现有通路实现功能革新，但新获取基因在不同防御系统中是否遵循统一作用机制、能否形成 通用功能模块 ，始终是领域内待解的核心科学问题。

近日，美国加州大学伯克利分校化学系、创新基因组学研究所Jennifer A. Doudna团队（Owen T. Tuck与Jason J. Hu为共同第一作者）在Science发表题为Recurrent acquisition of nuclease-protease pairs in antiviral immunity的研究论文。

该研究通过细胞实验、生化分析与系统发育追踪，明确三大核心发现：一是Hachiman、AVAST、Lamassu、DRT等4类进化独立的细菌抗病毒系统，均通过水平基因转移多次独立获取编码金属 -内酰胺酶（MBL）型核酸酶与胰蛋白酶样蛋白酶的基因对；二是这些基因对遵循 蛋白酶切割解除核酸酶门控抑制 的保守激活机制，且需依赖病毒感染信号调控以避免自身免疫损伤；三是鉴定出全新的caspase -核酸酶（canu）防御系统，其激活模式与真核凋亡通路存在进化相似性。

该研究为理解微生物免疫的模块化进化提供了关键实验证据。

研究团队首先通过序列同源性搜索（使用ClustalOmega、MAFFT工具）与结构预测（基于AlphaFold3）发现，Hachiman、AVAST、Lamassu、DRT等4类功能迥异的细菌抗病毒系统中，均存在共现的两类基因：一是编码MBL型水解酶超家族蛋白的基因（预测为核酸酶），二是编码胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

其中核酸酶基因通常位于上游，蛋白酶基因则与各系统的核心防御酶（如Hachiman的HamA、AVAST的Avs1a、Lamassu的LmuA）形成N端融合蛋白，这一基因排布在不同系统中高度保守。

系统发育分析（采用IQ-TREE 2构建进化树）进一步揭示，除少数DRT系统变异体外，这些系统均通过水平基因转移多次独立获取该核酸酶-蛋白酶基因对，且核酸酶与蛋白酶的进化树拓扑结构高度相似，表明二者存在紧密共进化关系，转移过程中始终以 配对形式 传递。

值得注意的是，该基因对还存在于未被注释的基因组 防御岛 （含转座酶等免疫相关元件）中，暗示其潜在免疫功能；且约 5% 的 Hachiman 系统中，蛋白酶 - HamA 融合蛋白的 HamA 结构域失去经典 D-GEXK 催化基序，表明这些系统通过 失活自身核酸酶功能、依赖新获取的 MBL 型核酸酶 实现免疫重塑，进一步印证该基因对的功能核心地位。

图1核酸酶-蛋白酶功能模块的跨系统分布与进化特征

为阐明该模块的作用机制，团队以Pseudomonas fluorescens的Hachiman系统（PflHamMAB locus）为模型展开研究。纯化的HamM（MBL型核酸酶）单独孵育时无DNA降解活性，AlphaFold3结构预测显示，其MBL结构域中存在两个无序插入片段，恰好覆盖核酸酶活性中心形成 门控 抑制状态 这与天然转化相关MBL核酸酶（如Bacillus subtilis ComEC）的结构存在显著差异。

将 HamM 与 HamAB 复合物（含蛋白酶 - HamA 融合蛋白、HamB 解旋酶）共孵育后，SDS-PAGE 检测到 42 kDa 的全长 HamM 消失，出现 3 个特异性水解片段；质谱分析（依托 QB3/Chemistry Mass Spectrometry Facility 平台）定位切割位点为插入片段中的异亮氨酸残基（I118、I218），且该切割具有高度特异性，HamAB 无法切割其他无关蛋白，突变异亮氨酸位点后切割完全消失。体外 DNA 降解实验显示，单独 HamM 或 HamAB 孵育质粒 DNA 时仅产生少量切口，二者共孵育时质粒 DNA 在 10 分钟内完全降解，且激活后的核酸酶可降解短双链 DNA、单链 DNA 及噬菌体 EdH4 的基因组 DNA，但不切割 RNA，证明其底物特异性为 DNA。

预切割 实验进一步证实，在 HamM 的异亮氨酸位点人工引入断裂后，即使无 HamAB 存在，该 预切割 HamM 也会对宿主 E. coli 产生显著毒性，直接证明插入片段的移除是核酸酶激活的关键。

该激活过程还需双重信号调控以避免误激活：噬菌体感染产生的DNA中间体可触发HamB解旋酶的ATP水解，而ATP存在时会抑制HamM切割，ATP水解后抑制解除；若加入非水解性ATP类似物（AMP-PNP），即使有DNA存在，HamM也无法被激活。

同时，删除HamA的dHamA结构域后蛋白酶无法激活核酸酶，而将dHamA替换为人类c-Jun的亮氨酸拉链二聚化结构域后，蛋白酶可自主激活核酸酶，证明HamA的寡聚化是蛋白酶活性的前提。综上，Hachiman系统的激活通路为：噬菌体DNA HamB解旋酶ATP水解 蛋白酶-HamA寡聚化 切割HamM的插入片段 核酸酶激活 DNA降解 细胞死亡/生长停滞 阻断噬菌体复制。

图2 Hachiman系统中核酸酶的激活机制与信号调控从DNA感知到核酸酶激活的完整通路，双重调控（DNA+ATP水解）与蛋白酶切割共同实现核酸酶的激活

为验证该机制的普适性，团队研究了与Hachiman无进化同源性的AVAST系统（Erwinia piriflorinigrans的EpiAvs locus） 该系统通过直接识别噬菌体末端酶激活，与Hachiman的DNA感知模式完全不同。

实验显示，EpiAvs系统的核酸酶（EpiAvs1a）同样含两个遮挡活性位点的插入片段及保守异亮氨酸切割位点（I134、I234）；突变这些位点后，EpiAvs对噬菌体P1的防御能力显著下降，双突变则完全失去防御功能；Western blot检测发现，噬菌体P1感染时EpiAvs1a被切割产生18.9 kDa的特异性片段，突变体无此片段。更关键的是，将Citrobacter sp. ESBL3的AVAST核酸酶替换EpiAvs1a，构建的嵌合系统仍能有效抵御噬菌体P1，证明该模块的功能可跨物种迁移，激活机制具有绝对保守性。

此外，Lamassu系统的核酸酶同样含类似插入片段，且激活依赖核心蛋白寡聚化，进一步证实 蛋白酶切割+寡聚化调控 是多系统共享的激活范式。

系统发育分析中，团队还意外发现一类特殊的核酸酶同源物：其伴侣蛋白酶并非胰蛋白酶样，而是与真核caspase家族（调控凋亡的关键蛋白酶）高度同源，形成 caspase -核酸酶 基因座（命名为canu系统）。

以Klebsiella aerogenes的KaeCanABC系统为模型研究发现，CanA（caspase同源物）的结构与人类MALT1类胱天蛋白酶（调控NF- B通路）的C端免疫球蛋白样（Ig样）折叠高度同源（DALI Z-score=20.7），且CanC（核酸酶）含保守的门控插入片段；表达KaeCanABC的E. coli可有效抵御噬菌体T4，低感染复数（MOI=0.01）时可完全阻止裂解，高MOI（10）时细胞才崩溃；突变CanA的caspase活性位点或CanC的切割位点均会丧失防御功能，体外实验显示CanA与CanB形成可溶性复合物，且CanAB浓度越高，CanC的DNA降解活性越强。

通过筛选 T4 逃逸突变体，团队发现所有逃逸突变均位于 dda 基因（编码 SF1 家族解旋酶，参与噬菌体 DNA 复制），表明 Canu 系统通过感知噬菌体解旋酶激活防御。这一发现首次证实原核生物中存在 caspase - 核酸酶 激活通路，与真核 caspase 介导的凋亡信号通路存在进化相似性，为理解免疫通路的跨域保守性提供了关键线索。

该研究通过多维度实验揭示了细菌抗病毒免疫的 模块化进化 规律，其科学价值体现在三方面：

理论层面，明确 核酸酶 - 蛋白酶对 是细菌免疫的 通用功能模块 ，通过水平基因转移实现跨系统功能拓展，修正了 不同防御系统独立进化 的传统认知；

机制层面，阐明 门控抑制 + 蛋白酶激活 + 多信号调控 的保守通路，为理解原核免疫的精准调控提供新范式，且首次建立核 caspase 与真核凋亡通路的进化关联；

应用层面，提供了基于 共进化特征（核酸酶 - 蛋白酶共现）+ 结构特征（门控插入片段） 的新型防御系统预测方法，为挖掘CRISPR 之外的抗病毒工具奠定基础 例如该模块的可控激活特性，或可用于优化基因编辑工具的脱靶效应。

目前，研究团队已将相关质粒（Addgene ID: 248931-248960）与噬菌体测序数据（NCBI SRA: PRJNA1353595）公开，补充材料可通过https://science.sciencemag.org/cgi/content/full/science.aea8769/DC1获取。

未来，对Canu系统多样性的深入探索、以及该模块在古菌中的分布研究，或将进一步揭示免疫通路的起源与进化规律。

原文链接：https://doi.org/10.1126/science.aea8769

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